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最常见的凝胶过滤色谱应用是蛋白聚集分析。此类分析需要保持分析物的天然状态，因此流动相缓冲液的pH应为7左右，其浓度不宜太高。方法开发可以100mM的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）为起点，并根据情况进行优化调整。
如果是疏水蛋白，则可加入5-10%有机溶剂，如甲醇、乙腈、异丙醇等。 如果是易于离子化的蛋白，如碱性蛋白或等电点较高的蛋白，则需要提高流动相的缓冲盐浓度以获得最佳的色谱结果。此时可选用两倍浓度的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS，含50mM磷酸盐和300mM氯化钠，pH 6.8），减少次级作用。
需要注意的是，提高缓冲盐浓度会增强疏水作用。此外，尽管可以通过调节缓冲盐浓度来改善某一个关键对的分离度，但有可能会同时减低另一个关键对的分离度。